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ProteanFect Max-CD34+ HSC(造血干細胞)轉染操作全攻略

更新時間:2025-03-04

閱讀:1317

ProteanFect Max (PT02) 轉染人源CD34+造血干細胞操作攻略


CD34+造血干細胞的分選

對于人源CD34+造血干細胞,合適的培養條件和轉染時間對細胞的成功轉染非常關鍵。CD34+造血干細胞分選后需要培養一段時間恢復細胞狀態后,以實現較高的轉染效率。以來自動員人單采血或臍帶血開始,可以使用市面上陽性選擇分選試劑盒分離得到CD34+細胞群。本實驗所用細胞為動員人單采血,分離試劑為Lymphoprep™(Stemcell,07861),分選試劑盒為CD34 MicroBead Kit, human(Miltenyi Biotec, 130-046-702)。具體實驗操作參考其官·方說明書。

注:在紅細胞數量較多的情況下,應先分離PBMC,再使用試劑盒進行分選。具體操作應根據所選材料和試劑盒說明書進行細胞分選。


CD34+造血干細胞完·全培養基的配制

SFEM II培養基(Stemcell,09655)和StemSpan™ CC100(Stemcell,02690)以99:1比例充分混合后使用(若添加抗生素則抗生素稀釋1000倍),配置完培養基放置于4℃冰箱儲存(盡量在1個月內使用完)。


CD34+造血干細胞的培養與傳代

1.分選得到的CD34+造血干細胞300 g離心5 min,用1 mL完·全培養基重懸后,取樣計數,根據計數結果用完·全培養基重懸到105 cells/mL活細胞密度,接種到T25培養瓶或細胞培養板中培養。

培養容器

每孔體積

細胞密度

T25

8.0 mL

105 cells/mL

6-well plate

2.5 mL

105 cells/mL

24-well plate

1.0 mL

105 cells/mL

48-well plate

0.5 mL

105 cells/mL








2.3天后補液一次,調整細胞密度至2×105 cells/mL,之后隔天補液調整密度至2×105 cells/mL ,培養時細胞密度控制在1.5×106cells/mL 以內。

注:若不及時補液,細胞狀態及后續擴增受不可逆影響。

3.推薦在CD34+造血干細胞分離后培養5-10天進行轉染。如果細胞分離后直接轉染或細胞傳代時間過長后再轉染,轉染后的細胞活力與轉染效率可能會降低或者CD34+造血干細胞比例偏低。對于使用上述動員單采血來源的CD34+造血干細胞,最佳的轉染時間點是在分離培養后的第5天。    


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使用ProteanFect Max(PT02)進行人CD34+造血干細胞轉染

1.轉染的核酸:mRNA

2.適合轉染的培養基:使用Opti-MEM培養基(或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養基)進行轉染。

3.配置ProteanFect Max轉染體系:具體詳見表1-3。轉染體系在配置過程中出現粘稠現象屬于正常。

4.轉染前細胞準備:確保細胞處于良好生長狀態,活率需超過90%。調整細胞轉染密度時,避免反復離心,以免延長處理時間,影響細胞活力和轉染效率。    

5.細胞轉染:孵育時間建議保持在15分鐘,適當延長時間可提高轉染率,但可能影響細胞活力。

6.轉染效率與細胞活率檢測:使用陽性對照mRNA時,可在轉染后5-48小時內觀察EGFP的表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍、AO/PI染色或流式細胞術等方法檢測,若細胞狀態良好,鏡下觀察可見細胞圓潤透亮。

表1. ProteanFectMax轉染人源CD34+造血干細胞實驗操作步驟說明

(以96孔板轉染mRNA為例)

操作步驟

人源CD34+造血干細胞

1 配置ProteanFect Max轉染體系


1.1 將Reagent A與mRNA混合

在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA,充分混勻(Reagent A使用前需顛倒混勻)

1.2 加入Reagent B輕柔充分混勻

往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B混勻一分鐘(動作輕柔避免產生氣泡)

1.3 加入Reagent C混勻

往上述混合物中加入8-13.5 μL Reagent C混勻(動作輕柔避免產生氣泡)a

2 轉染前細胞處理


2.1人源CD34+造血干細胞準備(洗滌盡量去除培養基,以免影響轉染效果)

取1×105 CD34+造血干細胞,加入Opti-MEM,300 g離心5分鐘,去上清,收集細胞沉淀,加入Opti-MEM重懸再洗滌一次,用20 μL Opti-MEM重懸細胞調至1×10? cells/mL備用

3 細胞轉染


3.1混合轉染體系與細胞        

將上述ProteanFect轉染液與20 µL細胞懸液混合均勻(動作輕柔避免產生氣泡)

3.2 孵育

37℃培養箱孵育15分鐘

3.3 終止反應與洗滌

加入至少200 µL完·全培養基,300 g離心5分鐘,棄上清(殘留約20μL液體)

3.4 細胞培養與觀察

加入適量完·全培養基,進行細胞培養,后續可根據實驗目的進行基因表達檢測



















a. 由于人源CD34+造血干細胞的個體差異較大建議先加入13.5 μL的Reagent C。如果細胞活率不佳,可將Reagent C的使用量下調至8 μL。

         

表2. ProteanFect Max轉染不同類型核酸的實驗操作步驟說明(以96孔板轉染為例)

操作步驟

人源CD34+造血干細胞

1 配置ProteanFect轉染體系

mRNAa

siRNAb

1.1 將Reagent A與核酸混合

在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA,充分混勻

在40 µL Reagent A中加入40 pmol siRNA,充分混勻

1.2 加入Reagent B

往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B

往上述混合物中加入1.4 μL Reagent B

1.3 加入Reagent C

往上述混合物中加入8 μL Reagent C

往上述混合物中加入13.5 μL Reagent C

2轉染前細胞處理

詳見表2

3 細胞轉染        

詳見表2












a. 建議mRNA濃度≥1 μg/mL。如需同時轉染多個mRNA,為確保在轉染多個mRNA時保持高效的轉染效果,加入的mRNA總量為0.5 µg。

b. 建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時轉染多個siRNA,為確保在轉染多個siRNA時保持高效的轉染效果,加入的siRNA總量為40 pmol。

    表3. ProteanFect Max轉染不同細胞培養孔板規格的各組分使用量

ProteanFect Max-CD34+ HSC(造血干細胞)轉染操作全攻略

a. 由于CD34+造血干細胞存在較大個體差異,建議對Reagent C進行多個梯度測試,以綜合考慮細胞活率和轉染效率,從而選擇最佳方案。Reagent C的使用量可低下調至初始量的50%。


細胞活率和表達效率分析

在轉染 EGFP mRNA后,可通過臺盼藍染色和流式細胞術對CD34+造血干細胞轉染后的細胞活力與轉染效率進行分析。首先通過熒光顯微鏡對轉染后細胞的EGFP蛋白質表達、細胞形態和活力進行定性評估(圖 1)。同時,收集轉染后的細胞進行臺盼藍染色檢測活細胞密度,流式染色PE anti-human CD34 Antibody(Biolegend ,343506)以定量分析CD34+造血干細胞的轉染效率。細胞收集完成后,離心棄去培養基,用1 × DPBS重懸細胞,加入PE anti-human CD34 Antibody,4℃避光染色15分鐘后洗滌去上清,用1 × DPBS重懸細胞,進行流式檢測(圖2)。

ProteanFect Max-CD34+ HSC(造血干細胞)轉染操作全攻略

圖1. 利用ProteanFect Max轉染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細胞中的表達。熒光圖(左)和明場圖(右)顯示,ProteanFect Max轉染人源CD34+造血干細胞中1天后。絕大部分細胞表達綠色熒光蛋白,說明ProteanFect Max在人源CD34+造血干細胞中中具有較高的轉染效率。

ProteanFect Max-CD34+ HSC(造血干細胞)轉染操作全攻略

圖2. 利用ProteanFect Max轉染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細胞中表達的流式分析圖。使用ProteanFect Max轉染試劑轉染EGFP mRNA,在轉染后24小時檢測到約有61.9%細胞表達EGFP蛋白。


常見問題


1. 如何提升轉染效率

1)延長轉染時間:根據細胞狀態適當延長轉染時間,通常不超過30分鐘。

2. 關于試劑盒中陽性對照的使用建議

首·次嘗試時,建議設置陽性對照組(EGFP mRNA),以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可,節省細胞和試劑。

2. 轉染時的細胞數范圍

說明書中提供了最佳轉染條件下的細胞數量范圍,但在特殊情況下,即使細胞數量較少,也可以進行轉染。以96孔板為例,建議細胞數量不低于2×105/孔,以確保后續檢測的可靠性。

3. 轉染后細胞狀態與活力

轉染后,細胞狀態可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉染時,對細胞活力的損傷較小。通常在轉染3天后,細胞狀態會基本恢復。

4. 轉染后細胞離心后看不到沉淀

對于小體積轉染體系(如96孔板),離心后細胞沉淀不明顯是正常現象。細胞沉淀可能散落在離心管側壁,不影響后續結果。為減少細胞損失,離心后移液時應避免槍頭緊貼底部。


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